一種用于測定人Ⅲ型前膠原的試劑盒及其測定方法

暫無

本發(fā)明涉及的是醫(yī)藥診斷試劑，特別是一種在放射免 疫法測定下的診斷肝纖維化的人Ⅲ型前膠原h(huán)PCⅢ診斷試 劑，其制備方法和其在放射免疫測定中的使用方法。\n據(jù)認(rèn)為肝纖維化是各種慢性活動性肝炎向肝硬化發(fā)展 的必經(jīng)階段，在肝硬化進(jìn)一步造成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害后， 才能被肝功能實(shí)驗(yàn)確診，但一般常規(guī)肝功能試驗(yàn)無法診斷 肝纖維化和早期肝硬化。目前臨床主要依靠肝活檢來判斷， 但此方法為創(chuàng)傷性檢查，且受穿刺部位的局限，并且難以 進(jìn)行肝纖維化進(jìn)展的動態(tài)觀察。根據(jù)肝硬化乃至肝癌的形 成和發(fā)展過程，世界肝病專家認(rèn)為阻止或減慢肝纖維化的 發(fā)生將會治愈大多數(shù)慢性肝病患者。因此，早期診斷肝纖 維化特別是在臨床上建立肝纖維化的可靠標(biāo)志物對于防止 肝硬化的形成和發(fā)展具有非常重要的意義。\n近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者報道，血清Ⅲ型前膠原肽 (Procollagen?type?Ⅲ?Peptide,PⅢP)是診斷肝纖維 化較好的血清學(xué)指標(biāo)。測定方法多采用放射免疫分析法， 所用抗原從動物胎皮中提取，如德國貝林格公司(Behr- ingwerke?Co.)生產(chǎn)的PⅢP放免試劑盒中的關(guān)鍵材料PⅢP 就是從牛胎皮中提取。也有從羊、鼠等胎皮中提取PⅢP的 報道。其作為診斷肝纖維化標(biāo)志物的依據(jù)是肝硬化早期以 Ⅲ型膠原(Collagen?type?Ⅲ,CⅢ)增多為主，細(xì)胞在 合成膠原時以前膠原形式分泌出細(xì)胞外，而血清PⅢP是Ⅲ 型前膠原(Procollagen?type?Ⅲ,PCⅢ)經(jīng)氨基端內(nèi)切肽 酶作用脫落下來的多肽鏈，所以測定PⅢP含量可以反映CⅢ 的代謝狀況。然而動物與人類膠原分子在結(jié)構(gòu)上的一些抗 原決定簇存在某些差異，必然對測定結(jié)果帶來影響。此外， 有些學(xué)者還發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的炎癥和壞死均可使在肝內(nèi)存在的 CⅢ裂解以致血清PⅢP值升高，因而血清PⅢP值不一定提示 膠原合成的增加，亦即是血清PⅢP值診斷肝纖維化會受到 其他因素的影響而不準(zhǔn)確。此外，目前從國外進(jìn)口PⅢP放 免試劑的價格非常昂貴，其具體的放免測定操作復(fù)雜，需 經(jīng)過復(fù)雜計算才可以得到病人血清中的PⅢP含量。\n本發(fā)明的目的是：1．提供一種包括從人工流產(chǎn)的死胎 皮膚中提取的人Ⅲ型前膠原(human?Procollagen?typeⅢ) 即hPCⅢ，其抗體anti-hPCⅢ，同位素標(biāo)記抗原125Ⅰ-hPCⅢ 的放免試劑盒；2．提供所述試劑盒的放射免疫測定方法。\n由于上述目的，本發(fā)明存在以下兩方面的內(nèi)容。\n一、一種用于放射免疫法測定人Ⅲ型前膠原的試劑 盒，包括純抗原試劑、抗體試劑、標(biāo)記抗原試劑和分離 劑；其特征在于：純抗原試劑為人Ⅲ型前膠原h(huán)PCⅢ，抗 體試劑為人Ⅲ型前膠原抗體anti-hPCⅢ，標(biāo)記抗原試劑為 標(biāo)記抗原125Ⅰ-hPCⅢ；其中：\n1、所述純抗原試劑hPCⅢ按法馬西(Pharmacia)公司 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)達(dá)到聚丙烯酰胺凝膠電泳純，用電泳考馬 斯亮蘭R250染色呈粉紅色，電泳圖譜觀察為單一區(qū)帶，經(jīng)β -巰基乙醇還原后電泳圖譜可見兩條區(qū)帶，分別代表肽鏈 Proαl(Ⅲ)和Pαl(Ⅲ)，前者的遷移率為0.238，蛋白 質(zhì)分子量為19萬，后者的遷移率為0.310，蛋白質(zhì)分子量為 17萬；\n2．所述抗體試劑anti-hPCⅢ為hPCⅢ免疫家兔獲得，其 工作液用0.1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA),2％(v/v)正常兔血 清(NRS)及0.1M,pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)配制；\n3、所述標(biāo)記抗原試劑125Ⅰ-hPCⅢ用1％(w/v)BSA,0.1M, pH7.4的PBS配制成濃度為每100微升液體每分鐘γ-射線計 數(shù)值(cpm/100μl)30000；\n4、分離劑為0.1M,pH7.4的PBS配制6％(w/v)聚乙二醇 (PEG)和羊抗兔抗血清(第二抗體)獲得。\n本發(fā)明有如下附圖：\n附圖1為hPCⅢ的PAGE圖譜；\n附圖2為SDS-PAGE圖譜；\n附圖3為從胎皮中純化hPCⅢ過程中的中間產(chǎn)物SDS- PAGE圖譜；\n附圖4為肝活檢纖維化程度與血清PCⅢ相關(guān)關(guān)系統(tǒng)計 圖；\n附圖5為病理肝纖維化分級為0級的病理標(biāo)本的顯微圖 像；\n附圖6為病理肝纖維化分級為輕級的病理標(biāo)本的顯微 圖像；\n附圖7為病理肝纖維化分級為中級的病理標(biāo)本的顯微 圖像；\n附圖8病理肝纖維化分級為重級的病理標(biāo)本的顯微圖 像。????\n本發(fā)明所述試劑盒中的試劑的質(zhì)量鑒定方法及結(jié)果如 下：\n1、參見附圖1，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及考馬 斯亮蘭R250染色鑒定，獲得的hPCⅢ為單一區(qū)帶，說明純 度已達(dá)到電泳純，箭頭所指區(qū)帶為粉紅色，符合膠原蛋白 特征；參見附圖2，經(jīng)β-巰基乙醇還原后電泳(SDS-PAGE) 可見兩條區(qū)帶，分別為Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)，但其遷 移率比牛Ⅲ型前膠原略低，圖中，各縱向區(qū)帶數(shù)字代表不 同物質(zhì)成分：1-PCⅢ(牛Ⅲ型前膠原)；2-hPCⅢ(人Ⅲ型前 膠原)；3-HMW(高分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn))；4-hPCⅠ(人Ⅰ型前 膠原)；5-CⅢ(Ⅲ型膠原)；其中縱向區(qū)帶2中：帶a-Pro ?α1(Ⅲ)，帶b-Pα1(Ⅲ)。經(jīng)與進(jìn)口法馬西公司高分子量 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(HMW)對照測定，獲得的hPCⅢ分子的亞單位的 分子量分別為：Proα1(Ⅲ)鏈190000道爾頓(Dolton, D),Pαl(Ⅲ)鏈170000D。而牛型Ⅲ型前膠原的Proαl (Ⅲ)鏈為170000D,Pα1(Ⅲ)鏈為150000D。參見附圖3： 從胎皮中純化hPCⅢ過程的中間產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜，看到 提純過程中hPCⅢ逐步被純化情況，圖中，1-DEAE-32層 析前，可見雜質(zhì)成分很多；2-DEAE-52層析前，可見雜質(zhì)量 減少很多；5-DEAE-52層析后，得到清晰兩條帶的純品hPC Ⅲ。當(dāng)原料來源太差時尚需增加的層析步驟：3,4-Sepha- dex?G100層析前，可見還混有少量雜質(zhì)成分，經(jīng)5-Sephadex G100層析后得到純品hPCⅢ。\n2、anti-hPCⅢ的鑒定：\n將上述制備的抗血清作系列稀釋，按放免法，不加競爭 性抗原，繪制抗血清稀釋曲線，測定其效價；免疫組織化學(xué)： 取肝硬化與慢性活動性肝炎病人各10例肝活檢標(biāo)本，將上 述制備的抗血清按效價稀釋至1∶100，該高價抗血清用于免 疫組織化學(xué)肝活檢標(biāo)本，在光學(xué)顯微鏡下可見肝硬化假小 葉之間的膠原纖維，證實(shí)為特異性抗體。\n3、將前述125Ⅰ-hPCⅢ用三氯醋酸法測定，放射化學(xué)純 度達(dá)99.6％。\n二．本發(fā)明所指的試劑的放射免疫測定方法系采用雙 抗體PEG法，非平衡法加樣，操作前試劑按以下容量分裝：\n1、hPCⅢ標(biāo)準(zhǔn)液：共7瓶，分別用S0～S6標(biāo)示，每瓶容量 1ml；其濃度分別為So?0μg/L,S1?25μg/L,S2?50μg/L, S3?100μg/L,S4?250μg/L,S5?500μg/L,S6?1000μg/L；\n2、PBS:1瓶，2ml；\n3、anti-hPCⅢ:3瓶，共22ml；\n4、125I-hPCⅢ:2瓶，共11ml；\n5、分離劑：3瓶，共22ml；\n6、質(zhì)控血清：1瓶，1ml。\n本發(fā)明用于放射免疫測定中的測定方法按以下操作步 驟：????\n(1)100μl標(biāo)準(zhǔn)液或待測病人血清標(biāo)本中加入100μ1 anti-hPCⅢ后，4℃放置42～48小時；\n(2)加人100μl計數(shù)值為30000cpm的125Ⅰ-hPCⅢ溶液， 4℃放置6小時；\n(3)加入分離劑200μl，室溫放置30分鐘；\n(4)4000轉(zhuǎn)/分，4℃～10℃條件下離心30分鐘；\n(5)吸棄上清液后用v計數(shù)儀測定沉淀物的放射性計數(shù) 值，其值用Bx表示(下標(biāo)x代表不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液或病人 標(biāo)本)；\n(6)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上以((B標(biāo)準(zhǔn)液-BNSB)/(Bo-BNSB))(％) (Bo代表最大結(jié)合，B標(biāo)準(zhǔn)液代表標(biāo)準(zhǔn)液結(jié)合，BNSB代表非特異性 結(jié)合)為縱坐標(biāo)，以hPCⅢ標(biāo)準(zhǔn)液濃度([hPCⅢ(μg/L)])為 橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；\n(7)用((B病人標(biāo)本-BNSB)/(Bo-BNSB))(％)反查標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即 可得到病人血清中hPCⅢ含量。????\n用上述操作步驟獲取的數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的競爭抑 制關(guān)系良好，落差大，測定范圍寬，完全滿足臨床測定要 求。靈敏度為6μg/L，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5.2％和 6.2％，回收率為97.6～102.3％，與其他類型膠原無交叉反 應(yīng)，方法穩(wěn)定。以上指標(biāo)已達(dá)到放射免疫法的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要 求。\n上述計算結(jié)果與肝活檢纖維化程度的關(guān)系：37例肝活 檢標(biāo)本經(jīng)H-E染色，按纖維化分布范圍和成纖維細(xì)胞增生 程度分為輕、中、重三級。無纖維增生者為0級。其血清 PCⅢ測定結(jié)果：病理0級，11例，血清PCⅢ為89.5±18.1 μg/L(下同)；輕級，10例，135.5±20.5；中級，8例， 260.8±39.2；重級，8例，369.8±68.0。血清PCⅢ隨肝 纖維化程度加重而遞增，兩者呈密切正相關(guān)(r=0.984,P ＜0.001)(參見圖4)。\n圖5圖8為其中4例有代表性的表現(xiàn)不同肝纖維化 程度的肝活檢標(biāo)本的病理顯微照片，其相應(yīng)的血清PCⅢ含 量為：圖5，病理0級，血清PCⅢ含量為58.9μg/L(下 同)；圖6，輕級，125.3；圖7，中級，210.2；圖8，重 級，323.5。證明本發(fā)明的測定結(jié)果與實(shí)際病情了一致。\n本發(fā)明的試劑及放免測定方法經(jīng)重慶市腫瘤醫(yī)院及全 國7所大醫(yī)院臨床試用，其效果參見下表： 重慶市腫瘤醫(yī)院????七家醫(yī)院結(jié)果綜合 組????別????????????例數(shù)????均值??±?標(biāo)準(zhǔn)差????例數(shù)????均值?±?標(biāo)準(zhǔn)差 正常對照????????????100?????85.0??±??17.5????265?????83.4??±?17.8 急性肝炎????????????22??????131.1?±??30.2????53??????111.2?±?30.1 慢遷肝??????????????18??????94.9??±??26.5????143?????93.6??±?26.2 慢活肝??????????????13??????188.2?±??73?9????122?????174.0?±?42.6 代償性肝硬化????????10??????277.4?±??91.0????13??????210.3?±?86.6 失代償性肝硬化??????20??????228.2?±??157.1???129?????211.1?±?67.9 肝硬化合并肝癌??????46??????288.7?±??101.4???62??????269.7?±?66.6 原發(fā)性肝癌(單純型)??22??????168.5?±??39.3 膽石癥??????????????12??????88.0??±??18.6????15??????87.9??±?16.6 其他：肝病??????????7???????88.2??±??28.0????23??????93.4??±?19.7\n非肝病??????????11??????88.6??±??10.5 從上表可以看出，肝硬化各組和慢活肝組病人血清PC Ⅲ升高最為顯著，慢遷肝、膽結(jié)石和其他疾病均無顯著升 高，充分說明肝細(xì)胞的炎性壞死對血清PCⅢ測定影響較 小，即PCⅢ能正確反映體內(nèi)肝纖維化發(fā)展程度。\n??????????????小?結(jié)\n1、從雷佛諾爾人工引、流產(chǎn)的死胎皮膚中提取、純 化人Ⅲ型前膠原，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和還原后亞單位 測定等證實(shí)人Ⅲ型前膠原為純品。\n2、用人Ⅲ型前膠原免疫家兔獲得高價抗血清，并經(jīng)免 疫組織化學(xué)試驗(yàn)證實(shí)肝臟膠原纖維可著色。\n3、Na125Ⅰ標(biāo)記人Ⅲ型前膠原，放化純度達(dá)到99.6％。\n4、建立的血清Ⅲ型前膠原放免法各項(xiàng)指標(biāo)均符合臨 床測定要求。\n5、臨床上測定281例血清Ⅲ型前膠原結(jié)果：100例正常 對照(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)為85.0±17.5μg/L(單位下略)，正 常上限為120；肝硬化組上升最高，代償性、失代償性和合 并肝癌組分別為227.4±91.0、266.2±157.5和288.7± 101.4；慢活肝組有顯著升高為188.2±73.9；急性肝炎組 和肝癌(單純型)組略有升高，各為131.1±30.2和168.5 ±39.3；慢遷肝、膽石癥和其他組均無明顯增高。\n6、37例肝活檢按纖維化程度分為：0、輕、中和重級， 其血清PCⅢ分別為89.5±18.1、135.5±20.5、260.8± 39.2和369.8±68.0。兩者呈密切正相關(guān)(r=0.984,P (0.001)。\n本發(fā)明的積極效果是：\n1、以hPCⅢ建立的放射免疫分析法測定血清Ⅲ型前膠 原指標(biāo)，能客觀地反映體內(nèi)肝組織纖維化程度，對診斷肝纖 維化及早期肝硬化的防治具有重要價值。\n2、用本發(fā)明所述方法能獲得hPCⅢ純品，用氯胺T法 標(biāo)記hPCⅢ時以半胱氨酸作還原劑所得的125I-hPCⅢ穩(wěn)定 性大于1.5月，明顯較以偏重亞硫酸鈉為還原劑的標(biāo)記方 法為好，對hPCⅢ分子的損傷很小，且放射化學(xué)純度達(dá)到 99.6％。\n3、操作簡單，所有成分均配制成應(yīng)用液體，分別按 順序加入即可，不必再作其他附加工作；待測的病人血清 不必作任何稀釋即可得到PCⅢ含量，測定范圍足夠臨床使 用；靈敏度達(dá)6μg/L，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為5.2％和 6.2％，回收率為97.6～102.3％，所有指標(biāo)均已達(dá)到放射 免疫法質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。